南京农业大学：苹果β-淀粉 酶基因家族新成员MdBAM17正调控淀粉降解参与ALA诱导的气孔开放

近日，Horticultural Plant Journal在线发表了南京农业大学园艺学院汪良驹教授团队题为“MdBAM17, a novel member of the β-amylase gene family, positively regulates starch degradation in ALA-induced stomatal opening in apple (Malus × domestica) （苹果β-淀粉梅基因家族新成员MdBAM17正调控淀粉降解参与ALA诱导的气孔开放）”的研究论文。

研究背景淀粉作为植物光合碳同化的主要产物，对气孔周期性昼夜开闭过程具有重要调节作用。（BAM）作为淀粉降解的关键酶类，已被证实能够促进淀粉的快速降解，促使气孔开启。然而，除拟南芥外，其他高等植物BAM的功能及其调控机制还了解甚少。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一种重要的植物生长调节物质，其改善植物光合碳固定能力与其调控气孔运动密切相关。本团队的研究已经证明，ALA能够逆转ABA引起的气孔关闭，从而促进逆境中气孔开放，增强光合固碳和农业增产增效。但是，人们对顺境下ALA如何促进气孔开放的作用机理缺乏了解。此前多项研究指出，ALA参与植物淀粉代谢调控。据此推测，ALA调控的气孔运动可能与淀粉降解相关。

研究问题

在正常生长条件下，探究ALA对苹果叶片气孔运动的调节作用，分析其与保卫细胞淀粉代谢之间的相互关系及其潜在的作用机理。

研究结果

（1）在一般的昼夜节律中，外源ALA处理能够促进光照后叶片气孔迅速开放，增大气孔开度。这种效应能够持续6-9 h（Fig.1, A, D）。使用mPS-PI和I2-KI两种方法染色以及（BAM）活性检测结果表明，ALA促进苹果叶片保卫细胞淀粉含量下降（Fig.1, B, C, E），同时促进下表皮BAM活性上升（Fig.1, F）。这表明ALA可能通过BAM介导保卫细胞淀粉降解进而参与气孔运动调节。

Fig.1 Dynamic changes of stomatal apertures, starch granules, and β-amylase activity within guard cells of apple leaves treated with ALA or not

（2）对苹果等10个蔷薇科物种BAM基因家族成员的进化保守性分析发现，苹果MdBAM17/20等同处于Group II-A分支上的13个BAM成员（除PbrBAM1b）与拟南芥AtBAM1高度保守。由于AtBAM1参与保卫细胞淀粉降解过程，因而推测，MdBAM17/20可能具有类似生物学功能（Fig.3）。

Fig.3 The gene structure, conserved motif distribution, multiple sequence alignment, and collinear correlation of the AtBAM1 orthologous genes in ten species of Rosaceae

（3）基因表达模式及其与BAM活性、保卫细胞相对淀粉含量以及气孔开度的相关性分析表明，MdBAM17在ALA调节的保卫细胞淀粉代谢和气孔运动过程中可能发挥正调控作用（Fig.4）。亚细胞定位显示，MdBAM17与AtBAM1亚细胞定位结果一致，均位于叶绿体内（Fig.5, A）。组织特异性表达分析显示，MdBAM17能够在保卫细胞中表达（Fig.5, B, C），且受ALA诱导（Fig.5, B-E）。

Fig.4 Relative expression of MdBAM17/20 in ALA-treated apple leaves and the correlation analysis between genes expression and β-amylase activity, relative starch amount, and stomatal apertures

Fig.5 MdBAM17 subcellular localization and effects of ALA on promoter activity of MdBAM17

（4）在苹果叶片中瞬时过表达（OE-）或沉默表达（RNAi-）MdBAM17能够显著影响保卫细胞内淀粉含量、BAM活性以及气孔开度（Fig.6）。ALA对保卫细胞淀粉含量、BAM活性以及气孔开度的调节作用在OE-或RNAi-MdBAM17叶片中被相应的显著增强或削弱（Fig.6）。这些结果表明，MdBAM17是介导保卫细胞淀粉降解进而参与ALA调控苹果叶片气孔开放的关键基因。

Fig.6 OE- or RNAi-MdBAM17 and ALA treatment affect the

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（4）在苹果叶片中瞬时过表达（OE-）或沉默表达（RNAi-）MdBAM17能够显著影响保卫细胞内淀粉含量、BAM活性以及气孔开度（Fig.6）。ALA对保卫细胞淀粉含量、BAM活性以及气孔开度的调节作用在OE-或RNAi-MdBAM17叶片中被相应的显著增强或削弱（Fig.6）。这些结果表明，MdBAM17是介导保卫细胞淀粉降解进而参与ALA调控苹果叶片气孔开放的关键基因。

（5）检测瞬时过表达（OE-）或沉默表达（RNAi-）MdBAM17的苹果叶片黄酮醇和H2O2含量结果显示，MdBAM17表达量的多寡并不影响ALA对保卫细胞黄酮醇和H2O2含量的调控作用（Fig.7）。而外源H2O2处理显著限制BAM活性和保卫细胞淀粉降解，但ALA能够有效降低ROS含量，缓解这种抑制效果（Fig.S6）。这些结果表明，ALA经由MdBAM17促进淀粉降解进而调控气孔开放的机制处于保卫细胞活性氧（ROS）信号通路的下游。

由于ROS属于逆境或ABA信号调控通路，在顺境条件下，ROS含量很低，因而，植物叶片气孔开度主要由BAM/淀粉信号来调节。

本研究探究了ALA在非逆境（无ABA/ROS存在）下调控苹果叶片气孔运动的机理，揭示了MdBAM17基因、BAM活性以及保卫细胞淀粉代谢介导气孔运动的分子机制，为正常生长发育条件下ALA促进叶片气孔开放与提高植物光合固碳能力提供了科学依据。