近期发表 | B-box转录因子MdBBX47通过直接和间接方式参与ALA诱导的苹果花青苷积累

2. ALA显著诱导MdBBX47表达

对苹果基因组MdBBX家族成员进行进化树分析显示，64个成员可分为5个不同组群（图2A）。其中17个MdBBX基因属于Group I，10个属于Group II，8个属于Group III，17个属于Group IV，12个属于Group V。由于Group II成员MdBBX20已被报道正调控苹果花青苷积累，因而，我们关注这一亚簇成员对ALA处理的响应。从图2B可以看出，MdBBX47对ALA的响应似乎比MdBBX20更敏感。在离体苹果叶片和愈伤组织中，我们也观察到外源ALA显著促进了MdBBX47的表达（图2C），说明它是一个重要的响应ALA处理的MdBBX转录因子。为了测试ALA对MdBBX47启动子转录活性的影响，我们进行了GUS染色和基因表达分析。结果显示，ALA增强显著MdBBX47启动子转录活性（图2D）。

4. MdBBX47在ALA诱导的花青苷积累中起关键正调控作用

在苹果果实或叶片中过表达MdBBX47 可显著促进花青苷含量增加，而RNAi沉默MdBBX47 则抑制花青苷的积累，而RNAi沉默MdBBX47 则抑制花青苷的积累（图4A和D）。用外源ALA处理转基因苹果叶片，可进一步增强过表达叶片着色，但对RNAi系的恢复作用有限。RT-qPCR显示，OE-MdBBX47上调了结构基因MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT 以及转运蛋白基因MdMATE8和MdGSTF12表达；RNAi则抑制了这些基因表达，说明MdBBX47是一个介导ALA诱导苹果花青苷积累的重要转录因子。

5. MdBBX47调节苹果愈伤组织花青苷积累

我们将OE-MdBBX47 和RNAi-MdBBX47 载体转入苹果愈伤组织，并添加外源ALA处理。结果显示，OE-OE-MdBBX47 显著促进花青苷积累，而RNAi-MdBBX47 抑制花青苷积累；外源ALA促进OE-MdBBX47细胞系花青苷积累，但对RNAi-MdBBX47 效应不明显（图5A-B）。花青苷生物合成和转运相关基因RT-PCR结果显示，OE-MdBBX47 使得所有检测基因，包括MdBBX47、MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT、MdMATE8和MdGSTF12表达上调，而RNAi-MdBBX47 导致这些基因表达下调（图5C)。进一步，利用RT-qPCR检测近期报道的参与ALA诱导花青苷积累的12个关键转录因子基因的表达。结果显示，绝大多数转录因子包括MdMYB9/10/110a、MdbHLH3、MdTTG1、MdMADS1、MdERF78、MdHsfB3a 和MdWRKY71 等在OE-MdBBX47 愈伤组织中表达上调，而在RNAi-MdBBX47 中表达下调（图5D)，说明这些转录因子可能位于MdBBX47下游发挥调控作用

6. MdBBX47直接结合MdCHS和MdUFGT启动子并激活其转录

为了明确MdBBX47与其下游靶基因启动子的直接互作关系，我们首先分析所有花青苷生物合成和转运相关基因启动子的顺式元件，然而，只有MdCHS和MdUFGT启动子中存在一个和两个基序CACGTG (G-box)(图6A)。因而，克隆这两个结构基因2000 bp启动子区域并开展酵母单杂（Y1H）实验。结果表明，只有共转AD-MdBBX47和ProMdCHS 或ProMdUFGT 的酵母能在添加75 mM 3-AT的SD/−Trp/−His/−Leu培养基上正常生长，从而证实MdBBX47可以直接结合MdCHS和MdUFGT 的启动子(图6B)。EMSA进一步证明，MdBBX47与MdCHS 和MdUFGT 启动子G-box基序结合具有特异性。如图6C，MdBBX47可以结合两个基因启动子中的G-box基序，且随着冷探针浓度增加，结合能力减弱。突变探针加入后，结合效应消失。

7. MdBBX47激活MdCHS和MdUFGT启动子

LUC和GUS实验表明，MdBBX47正调控下游靶基因表达（图7）。将MdCHS 和MdUFGT 的2000 bp启动子区域插入LUC基因上游，构建ProMdCHS-LUC 和ProMdUFGT-LUC 报告载体。将全长MdBBX47 克隆并重组至CaM35S启动子下游，构建35S::MdBBX47 效应载体。LUC活性测定显示，MdBBX47共转化显著增强MdCHS 和MdUFGT 的启动子活性。在GUS检测体系中，MdBBX47显著增强由MdCHS 或MdUFGT 启动子驱动的烟草叶片GUS染色，并伴随更高的GUS 基因表达。这些结果表明，MdBBX47通过特异性结合MdCHS 和MdUFGT 启动子中的G-box基序，正调控花青苷合成

8. MdBBX47结合MdMYB110a启动子间接促进花青苷积累

除了直接激活花青苷生物合成结构基因（如MdCHS和MdUFGT）表达，MdBBX47还可能调控其它转录因子基因表达，间接介导ALA诱导花青苷积累。图8显示，7个花青苷相关转录因子基因，包括MdMYB9、MdMYB110a、MdbHLH3、MdWRKY71、MdTTG1、MdHsfB3a 和MdERF78 启动子区域至少含有一个BBX结合的潜在位点G-box元件。于是，我们采用Y1H、EMSA、LUC和GUS来验证其结合的可能性。结果表明，MdBBX47可以结合MdMYB110a 启动子，但不能结合其他基因。EMSA进一步证实，MdBBX47直接且特异性地与MdMYB110a 启动子中G-box基序互作。此外，LUC和GUS测定显示，MdBBX47对下游MdMYB110a具有转录激活功能。综上所述，MdBBX47直接结合MdMYB110a 启动子中G-box元件并激活其转录，间接参与ALA诱导的花青苷生物合成调控。

利用Y2H和LCI实验（图9）证实，MdBBX47与光信号核心转录因子MdHY5存在蛋白互作，暗示两者可能协同调控光诱导的花青苷合成。