MdPHYB2-MdPIF1 模块通过调控 MdWRKY71 表达介导 ALA增强的苹果耐盐性

5-氨基乙酰丙酸（ALA）作为一种新型植物生长物质，能显著提高植物耐盐性。我们先前利用转基因的苹果离体叶片、未生根植株和愈伤组织细胞研究发现，转录因子MdWRKY71可以转录激活MdSOS2、MdNHX1、MdCLC-g、MdSOD1、MdCAT1和MdAPX1等基因表达，通过调控Na⁺/Cl⁻平衡和氧还平衡来提高苹果耐盐性。本研究则利用MdWRKY71转基因苹果生根植株进一步证实，过表达(OE-)MdWRKY71可增强耐盐性，干扰表达(RNAi-)MdWRKY71则削弱苹果耐盐性；外源ALA可以进一步增强MdWRKY71过表达效应， 同时缓解RNAi抑制效应。

研究内容 ╱

1. MdWRKY71介导ALA提高苹果生根植株的耐盐性

利用转基因苹果生根植株研究发现，非盐胁迫下不同基因型植株生长差异不大；200 mM NaCl胁迫下，OE-MdWRKY71叶片褐化减轻、RNAi植株更加敏感。OE-MdWRKY71植株和ALA处理可以维持较高的叶片相对含水量、叶绿素含量、净光合速率（Pn），降低MDA含量；同时将优先将Na⁺、Cl^-截留在根中，而不影响K⁺、NO3^-向地上部运输，因而，降低叶片Na⁺/K⁺和Cl^-/NO3^-比值，提升整株耐盐性。

2. MdWRKY71结合MdPIP2;1、MdTIP1;4与MdVHA-d1基因启动子并激活其转录活性

前期研究发现，ALA与MdWRKY71通过上调MdNHX1和MdCLC-g表达促进Na⁺和Cl⁻区隔至液泡中。本研究显示，它们还能改善盐胁迫下叶片相对含水量，故推测MdWRKY71和ALA可能调控V-H⁺-ATPase（VHA）和水通道蛋白（AQP）基因表达，以维持液泡膜功能与水分稳态，从而增强耐盐性。分析苹果基因组42个MdAQP和27个MdVHA的启动子发现，有17个MdAQP和14个MdVHA启动子含MdWRKY71结合的W-box。NaCl+ALA处理下，仅MdPIP2;1、MdTIP1;4、MdSIP1;1/1;2及11个MdVHA被显著诱导。OE-MdWRKY71上调其中7个基因，RNAi则抑制之。LUC、Y1H和EMSA证实，MdWRKY71直接结合MdPIP2;1、MdTIP1;4与MdVHA-d1启动子W-box并激活其表达，从而揭示了ALA通过MdWRKY71转录调控盐胁迫下苹果叶片水分平衡与液泡膜功能的分子机制。

3. MdPHYB2正向而MdPIF1负向调控ALA增强的苹果愈伤组织和烟草耐盐性

综合本研究与前文（Li等，2025)结果，作者提出一个MdPHYB2-MdPIF1-MdWRKY71级联调控模型：盐胁迫下，ALA增强MdPHYB2表达并抑制MdPIF1表达，解除MdPIF1对MdWRKY71及MdSOS2和MdSOS3的转录抑制。MdWRKY71促进液泡膜H⁺-ATPase基因（MdVHA-d1）、蛋白激酶基因（MdSOS2）、盐离子运输基因（MdNHX1和MdCLC-g）、抗氧化酶基因（MdSOD1、MdCAT1和MdAPX1）和水通道蛋白基因（MdPIP2;1和MdTIP1;4）转录激活，维护液泡膜功能，促进盐离子截留于根系，减少向地上部积累，提高抗氧化酶活性，并维持叶片水分平衡，进而参与ALA提高的苹果耐盐性（图5）。本研究为解析ALA改善植物耐盐性提供了新见解，为苹果耐盐性改良提供新的候选基因。