汪良驹团队在Horticultural Plant Journal正式刊发论文：MdWRKY71作为正向调节因子参与5-ALA诱导的苹果耐盐性

近日，Horticultural Plant Journal正式刊发南京农业大学园艺学院汪良驹教授团队题为“MdWRKY71 as a positive regulator involved in 5-aminolevulinic acid-induced salt tolerance in apple（MdWRKY71 作为一个正向调节因子参与5-氨基乙酰丙酸诱导的苹果耐盐性）”的研究论文。

1. 研究背景：

苹果属于中度盐敏感型果树，土壤盐渍化时常困扰着苹果生长与生存。尤其是，近年来由于肥水管理不当引起的土壤次生盐渍化，严重影响苹果生长发育、产量和品质，因此有效提高苹果耐盐性具有社会和经济重大意义。

5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）是一种新型植物生长调节物质。在草莓受到盐胁迫时，ALA能够提高植株叶片与根系的抗氧化酶活性，并且诱导Na⁺和Cl⁻截留于根中，从而减少其吸收运输以及在叶片中积累，进而达到增强植物耐盐性的目的。在苹果上，ALA可以促进花青苷合成，进而促进苹果着色，而且这一过程经由转录因子MdWRKY71介导。然而，MdWRKY71能否介导ALA提高苹果耐盐性，迄今未见到报道。

2. 研究问题：

探究ALA和MdWRKY71缓解苹果盐胁迫伤害效应，分析MdWRKY71调控的下游基因及其在苹果耐盐中的作用机理。

3. 研究结果：

(1) 将嘎啦苹果叶片置于在盐溶液中，24 h时出现叶片盐伤害症状(Fig. 1)。这种伤害程度随着盐处理时间延长而加重，叶片失绿，细胞死亡。若添加外源ALA，则显著减轻叶片褐化，减少细胞伤害，缓解盐胁迫引起的叶绿素含量下降。qRT-PCR检测显示，NaCl显著上调MdWRKY71表达，而ALA能进一步促进MdWRKY71表达。亚细胞定位结果显示，MdWRKY71蛋白位于细胞核内；GUS染色显示，MdWRKY71启动子活性受到NaCl和ALA的显著诱导，证明这是一个响应NaCl和ALA处理的转录因子。

Fig. 1 ALA promotes salt tolerance of apple leaves and MdWRKY71 is an ALA-responsive transcription factor under salt stress

(2) qRT-PCR检测显示(Fig. 2)，苹果叶片蛋白激酶基因MdSOS2、Na⁺转运蛋白基因MdSOS1、MdSOS3和MdNHX1，Cl⁻转运蛋白基因MdCLC-a/b、MdCLC-c1和MdCLC-g以及抗氧化酶基因MdSOD1、MdPOD1、MdCAT1、MdAPX1和MdGR1的表达均响应盐胁迫刺激，而ALA可以进一步促进这些基因表达，暗示ALA提高苹果耐盐性可能与其调控离子平衡和活性氧平衡有关。

Fig. 2 ALA promotes gene expressions associated with salt tolerance in apple leaves under NaCl stress

(3) 过表达（OE）-MdWRKY71能显著减轻盐胁迫对嘎啦苹果叶片伤害以及愈伤细胞生长的抑制，缓解叶绿素含量下降，同时促进抗氧化酶（SOD，CAT，APX）活性提高，抑制H₂O₂、O₂^•¯积累和MDA上升；而干扰（RNAi）-MdWRKY71表达则呈现相反趋势。ALA显著增强三种基因型苹果离体叶片和愈伤细胞耐盐性(Fig. 3)，证明ALA可能通过MdWRKY71来增强苹果抗氧化酶活性，进而提高叶片和愈伤细胞耐盐性。

Fig. 3 MdWRKY71 is involved in ALA-enhanced salt tolerance of apple

(4) 将OE-MdWRKY71转入烟草，则转基因植株耐盐性显著提高。ALA处理可以提高野升型烟草植株耐盐性，还能进一步提高转基因植株耐盐性(Fig. 4)。在这过程中，MdWRKY71和ALA缓解盐胁迫诱导的叶片叶绿素下降，提高叶片相对含水量，抑制Na⁺和Cl⁻含量上升，缓解K⁺和NO₃⁻含量下降。对于根系来说，MdWRKY71和ALA促进Na⁺和Cl⁻在根系中积累。这种根系截留盐离子同时减少叶片积累的特性是MdWRKY71和ALA提高植物耐盐性的重要机制。

Fig. 4 OE-MdWRKY71 and ALA treatment improve salt tolerance in tobaccos

(5) LUC和GUS染色显示，MdWRKY71可结合（蛋白激酶基因MdSOS2）、离子转运基因（MdNHX1、MdCLC-g）和抗氧化酶基因（MdSOD1、MdCAT1、MdAPX1）启动子，并上调基因表达(Fig. 5)。

Fig. 5 MdWRKY71 binds to the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1, and MdAPX1 to activate gene expressions

EMSA显示，MdWRKY71可以特异性结合MdSOS2、MdNHX1、MdCLC-g、MdSOD1、MdCAT1，MdAPX1启动子上的W-box (Fig. 6)。

Fig. 6 EMSA analyses show that MdWRKY71 binds to the W-box of the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1 and MdAPX1

4. 意义和创新性：

本研究报道，外源ALA可以提高苹果耐盐性，MdWRKY71表达可以被盐胁迫和ALA诱导，并以转录因子形式作用于Na⁺和Cl⁻运输以及抗氧化酶基因启动子上游，提高基因转录活性，促进盐离子外排出质膜，或区隔化于液泡内。这样，既避免盐离子毒害，又作为廉价渗透溶质，提高植株吸水能力；同时，由于上调抗氧化酶基因表达，酶活性提高，可以清除活性氧自由基。因而，本研究成果从离子毒害和氧化胁迫两个方面解释了ALA提高苹果耐盐性的机理，从而为ALA在苹果耐盐实践中应用提供了理论依据。同时，新挖掘出的MdWRKY71基因可望应用于耐盐苹果育种实践。

作者及其团队介绍：硕士毕业研究生李亚格和钟山青年研究员张留孜为该文共同D一作者，汪良驹教授和仲岩副教授为该文通信作者，硕士毕业研究生袁舟宇和科研助理张建婷参与本研究。

汪良驹教授是江苏省植物生理学会植物生长物质与生长调控委员会主任。他于2000年起开始从事ALA在农林作物抗逆增产提质增效及其生物学基础研究。其研发的产品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已大面积应用于国内20多个省市区农业生产区。其团队先后获得20多项政府专项资金资助，在国内外学术期刊发表与ALA有关研究论文100余篇，授权专利20余项，处于5-A农业领域研究前沿。

基金介绍：该研究获得自然科学基金(32230097和32172512)、江苏省碳达峰碳中和前沿基础专项资金(BK20220005)、江苏省农业科技自主创新B类项目[CX(20)2023]和江苏省高校优势学科等项目的资助。