MdPP2AC与MdCLC互作介导ALA诱导的苹果耐盐性

1. ALA增强苹果耐盐性并特异性诱导MdPP2AC表达

盐胁迫下，ALA预处理可显著缓解苹果无根苗叶片褐化，缓解叶绿素含量下降；NaCl可诱导PP2A酶活性上升，ALA进一步强化该效应。在MdPP2AC家族中，只有基因ID为LOC103451899的MdPP2AC受到盐胁迫和ALA共同上调，启动子活性也被二者共同激活，提示 MdPP2AC可能是ALA诱导苹果耐盐性的重要候选基因。

图1 ALA增强苹果耐盐性及MdPP2AC表达响应

2. MdPP2AC是ALA诱导苹果耐盐性的正调控因子

过表达MdPP2AC（OE）可显著提升苹果叶片耐盐性，减少盐胁迫导致的细胞死亡，维持叶绿素含量，增强SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，抑制H₂O₂ 、O₂^•¯ 及MDA积累，促进脯氨酸合成；PP2A特异性抑制剂（CT）则加剧盐损伤，而ALA可缓解CT的抑制效应。这些证据显示，MdPP2AC是ALA诱导苹果耐盐通路的关键下游因子。

图2 MdPP2AC介导 ALA 促进苹果愈伤组织耐盐性

3. MdPP2AC介导 ALA 促进苹果愈伤组织耐盐性

在正常生长条件下，野\生型（WT）、OE-MdPP2AC及 RNAi-MdPP2AC苹果愈伤组织生长没有显著差异；而在盐胁迫条件下，OE-MdPP2AC 愈伤组织的鲜重显著高于 WT 和 RNAi，抗氧化酶活性增强，O₂^•¯和 MDA 积累减少，同时Cl⁻含量显著升高。进一步添加外源ALA，则OE-MdPP2AC细胞系上述生理响应被进一步增强，但RNAi-MdPP2AC明显削弱ALA的促进效应。这些结果说明，MdPP2AC促进苹果细胞内Cl⁻积累与氧化还原稳态，在ALA增强苹果愈伤组织耐盐性中发挥关键作用。

图3 MdPP2AC对苹果愈伤组织耐盐性的影响

4. MdPP2AC促进根部 Cl⁻截留并减少向地上部运输

盐胁迫下，OE-MdPP2AC 生根苗叶片褐化程度更轻，叶绿素含量和相对含水量更高，抗氧化能力更强；OE 株系根部Cl⁻含量显著升高，叶片Cl⁻含量降低，CT 处理则相反，ALA 可逆转 CT 的影响。MQAE 荧光探针检测证实，OE-MdPP2AC促进根系成熟区Cl⁻积累，ALA 进一步增强该效应，表明 ALA诱导的MdPP2AC能够促进Cl⁻截留于根系成熟区以维持植株氯离子稳态。

图4 MdPP2AC调控苹果根部Cl⁻分布及耐盐性

5. 苹果全基因组MdCLC成员鉴定及其对NaCl和ALA的响应

Cl⁻跨膜转运和区室化由氯离子通道蛋白（CLC）介导。在苹果基因组中，存在着11个MdCLC家族成员，可分为6个亚家族（标记为b-g），其中 MdCLC-b1/c1/c2/d1的表达受 MdPP2AC 和 ALA 上调，提示这些基因可能参与 MdPP2AC 介导的 ALA 诱导苹果耐盐通路。

图5 MdCLC基因家族成员的全基因组鉴定及其对NaCl和ALA处理的响应

6. MdPP2AC 与液泡膜蛋白 MdCLC-c2 互作

酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和萤火虫荧光素酶互补（LCI）实验证实，MdPP2AC 可与 MdCLC-c2 直接互作，与 MdCLC-b1 弱互作，不与 MdCLC-c1 互作。亚细胞定位显示，MdCLC-c2 与液泡膜标记蛋白 RFP-VAC 共定位，确认为液泡膜蛋白。

图6 MdPP2AC 与 MdCLC-c2 互作验证及定位

7. MdCLC-c2 的 C 端 Glu⁶⁸⁴残基是互作关键位点

AlphaFold 预测显示 MdPP2AC 与 MdCLC-c2 的 C 端 CBS 结构域互作；截短实验表明，MdCLC-c2 的 aa^488-539和 aa^540-758区域是互作必需的。点突变实验证实，Glu⁶⁸⁴→Ala可完全阻断二者互作，表明 Glu⁶⁸⁴是 MdPP2AC 与 MdCLC-c2 互作的核心残基。

图7 MdPP2AC 与 MdCLC-c2 互作关键位点鉴定

8. MdPP2AC 与 MdCLC-c2 协同 ALA 增强酵母耐盐性

酵母Δgef1突变体对盐敏感，异源表达MdCLC-c2可部分恢复耐盐性，共表达MdPP2AC则显著增强该效应，ALA处理进一步提升耐盐性。胞内Cl⁻含量检测显示，MdCLC-c2 可促进 Cl⁻积累，MdPP2AC和ALA协同强化该过程。以上实验证实，二者通过调控Cl⁻转运增强细胞耐盐性。