MHOrT | 汪良驹团队：5-氨基乙酰丙酸（ALA）通过抑制PpARF9-PpGH3.1生长素结合模块促进桃果实早期发育

近日，Molecular Horticulture在线发表了南京农业大学园艺学院汪良驹教授团队的研究性论文，题为5-Aminolevulinic acid promotes cell division and young fruit development by suppressing the PpARF9–PpGH3.1 auxin-conjugation module in peach。该研究综合运用组织解剖学、植物积素定量分析、转录组测序和基因功能验证等手段，揭示了ALA通过下调PpARF9和PpGH3.1的表达，减少生长素-氨基酸结合，维持高水平游离IAA，从而促进桃果实细胞分裂与早期发育的分子机制，为ALA在果树生产上的应用提供了重要理论依据。

背景介绍

桃（Prunus persica L.）是全世界重要的温带落叶果树之一。其果实大小直接影响到产量和商品价值。果实发育主要由细胞分裂和细胞增大两个过程组成。其中前者受生长素（auxin）等多种植物积素的精密调控。5-氨基乙酰丙酸（ALA）是汪良驹教授团队长期研究的一种新型多功能植物生长调节物质，已在多种作物中被证实能够促进叶片光合作用，增加光合产物积累，提高产量，并改善产品品质。但是，ALA增大果实体积，尤其是与生长素信号通路的交互关系并不清楚。在生长素信号通路中，ARF转录因子和GH3酰胺合成酶是核心组分——GH3能够催化游离IAA与氨基酸结合，降低游离生长素含量，减弱生长素效应。因此，ALA是否通过ARF-GH3模块调控生长素代谢进而影响果实发育，是本研究拟将解决的核心科学问题。

研究结果

1. ALA促进桃果实早期生长——增加中果皮细胞数量

田间试验表明，外源ALA处理后第3至5周，桃果实体积和重量显著增加（Fig.1）。石蜡切片观察发现，ALA处理果实的中果皮细胞数量显著高于对照，而细胞面积略小于对照，说明ALA主要通过促进细胞分裂而非细胞体积来增大果实。

2. ALA影响桃果实种子和中果皮中多种积素水平——主要的是生长素

积素测定显示，ALA处理显著提高种子中IAA及其前体物质（IAM、IAN、IPyA）水平，同时增加细胞分裂素类物质TZR和IP含量(Fig.2)。在中果皮中，ALA显著提高游离IAA水平，并降低IAA-天冬氨酸（IAA-Asp）和IAA-谷氨酸（IAA-Glu）等结合态IAA的含量，提示ALA可能通过抑制IAA与氨基酸结合来维持较高水平的游离生长素。

3. 转录组分析揭示ALA调控的差异表达基因——PpARF9的挖掘

对ALA处理后3至5周的种子和中果皮进行转录组测序(Fig.3)。KEGG富集分析表明，差异表达基因（DEGs）显著富集于"植物积素信号转导"通路，尤其是，大量与生长素代谢、转运和信号转导相关的DEGs表达受到ALA调控(Fig.4)，其中转录因子PpARF9的表达因ALA处理而持续下调。相关分析表明，该基因表达水平与果实重量、中果皮细胞数量等显著负相关。

ALA喷施后第3至第5周桃幼果的转录组分析

IAA含量与生长素相关差异表达基因的相关性分析

4. PpARF9负调控桃果实细胞分裂的功能验证

进化分析显示，ARF9在被子植物中高度保守（Fig.5A-C）。在桃愈伤组织中过表达PpARF9显著抑制细胞分裂相关基因（如PpCDKBs、PpCYCs）的表达，并抑制细胞增殖；而RNA干扰PpARF9则显著促进细胞分裂。ALA处理能够消除PpARF9过表达对细胞分裂的抑制作用，表明ALA通过下调PpARF9以促进细胞分裂（Fig.5G-I）

5. PpGH3.1是PpARF9的下游靶基因，负调控ALA促进的细胞分裂

酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告（DLR）和凝胶迁移阻滞（EMSA）等实验证实，PpARF9能够直接结合PpGH3.1启动子中的生长素响应元件（AuxRE: TGTCTC），并激活其转录（Fig.6）。PpGH3.1属于GH3家族Group II成员，编码IAA-酰胺合成酶，催化IAA与氨基酸（Asp和Glu）结合反应。该蛋白定位于叶绿体（Fig.7D）。在桃愈伤组织中过表达PpGH3.1抑制了细胞分裂基因表达和细胞增殖，而ALA通过PpARF9通路下调PpGH3.1表达，减少IAA-氨基酸生成，维持较高游离IAA水平，从而有利于细胞分裂（Fig.7E-J）。

PpARF9对下游基因PpGH3.1的转录调控

PpGH3.1在ALA调控桃愈伤组织细胞分裂中的功能鉴定

6. 工作模型

该研究提出一个ALA-PpARF9-PpGH3.1调控模块促进桃果实早期发育的工作模型(Fig.8)：外源ALA处理抑制PpARF9转录，进而解除PpARF9对下游靶基因PpGH3.1的转录激活；PpGH3.1表达下调后，位于叶绿体内的PpGH3.1酶催化IAA-氨基酸结合反应减弱，游离的活性IAA维持较高水平，激活细胞周期相关基因（如PpCYCD3-3、PpCDKBs）表达，促进中果皮细胞分裂，最终促进桃果实早期发育和最终果实大小。由于ARF9和GH3.1在被子植物中高度保守，ALA这种调控果实发育的模式可能在不同物种中具有普适性。

ALA促进桃幼果发育的工作模型

南京农业大学园艺学院汪良驹教授为本文通讯作者，在读博士研究生甘星为NO1作者，张建婷、刘龙博、张留孜、Mohsin Iqbal、赵庆泽参与了本研究的各项工作。本研究受到自然科学基金（32272641、32230097、32172512）及江苏省农业自主创新资金重大项目（CX(20)2023）的资助。