ALA相关文章|ALA诱导苹果花青苷积累的分子机制研究

近日，南京农业大学园艺学院汪良驹教授团队研究论文《Transcription factor MdNAC33 is involved in ALA-induced anthocyanin accumulation in apples》在国JIZHU名期刊《Plant Science》上在线发表。该研究探讨了NAC转录因子参与ALA诱导苹果花青苷积累的分子机制，为ALA在GAO品质苹果生产上推广应用提供了新的理论依据。

研究背景

  5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一种新型天RAN植物生长调节物质，能够促进多种果实花青苷积累。然而，其潜在的机制仍然不清楚。在先前的一项转录组研究中，我们发现多个转录因子（TFs）在ALA诱导苹果花青苷积累过程中具有重要作用。在本研究中，我们专门探究了苹果NAC转录因子MdNAC33与ALA诱导的苹果花青苷积累的关系，并且运用多种分子生物学手段，解析了MdNAC33调控ALA诱导花青苷积累的分子机制。

研究内容

1.ALA正向调控苹果MdNAC33的表达

  苹果果实在光照下果皮花青苷含量不断上升，其间MdNAC33表达量上升；若用外源ALA处理，则果皮花青苷积累更多，同时，MdNAC33表达量也上升更多，说明MdNAC33与ALA促进的花青苷积累存在正相关关系。我们克隆MdNAC33上游2000bp启动子序列，并连接到GUS报告基因上游，瞬时转化苹果叶片，并用ALA处理。结果发现，ALA处理显著提高MdNAC33启动子的转录活性，说明MdNAC33可能参与ALA诱导的苹果花青苷积累。

2.MdNAC33参与ALA诱导的花青苷的积累

  为了明确MdNAC33在ALA诱导的苹果花青苷积累中的作用，我们构建MdNAC33超表达与RNAi干扰表达载体，并通过农杆菌转化法瞬时转化至苹果果皮或叶片，或者稳定转化至‘王林’苹果愈伤组织。结果发现，无论是哪个体系，超表达(OE-)MdNAC33均能显著提高苹果中花青苷含量，同时ALA具有增效效应；而干扰(RNAi-)MdNAC33表达后，则苹果花青苷含量显著降低，且ALA能缓解这种抑制效应。此外，RT-qPCR检测发现，MdbHLH3、MdDFR和MdANS在转基因苹果中的表达量发生明显变化，暗示着这些基因可能作为MdNAC33下游靶基因，共同参与苹果花青苷合成调控。

图2. MdNAC33参与ALA诱导苹果花青苷的生物合成的功能分析

3.MdNAC33与MdbHLH3、MdDFR和MdANS的启动子结合并激活其转录

  由于MdbHLH3、MdDFR和MdANS在转基因苹果中的相对表达量出现明显变化，猜想，MdNAC33可能通过激活这些基因的表达来调节花青苷积累。于是，我们克隆了这些基因上游2000bp的启动子区。通过酵母单杂（Y1H）发现，MdNAC33可以与MdbHLH3、MdDFR和MdANS启动子结合。EMSA实验也证明了这种结合。同时，我们开展双荧光素酶及GUS报告基因实验，证明MdNAC33可以激活MdbHLH3、MdDFR和MdANS的启动子。其中，MdNAC33转录激活的MdbHLH3可以促进MdDFR和MdUFGT转录，而MdNAC33转录激活的MdDFR和MdANS也促进花青苷合成。

图3. Y1H及EMSA证明MdNAC33与花青苷合成和调控相关基因启动子结合

4.MdNAC33与MdMYB1互作，促进花青苷合成与积累

已知MBW (MdMYB1、MdbHLH3、MdbHLH33、MdTTG1)蛋白复合物在苹果花青苷合成调节中发挥重要作用。为了检验MdNAC33与这些传统转录因子的关系，我们进行Y2H、LCI和BiFC实验。结果表明，MdNAC33与MdMYB1互作，并通过后者来上调MdUFGT和MdGSTF12表达，从而促进花青苷合成与积累。

图4. MdNAC33与MdMYB1的互作分析

综上所述，我们发现MdNAC33在ALA诱导苹果花青苷积累中起到关键作用。基于此，我们提出MdNAC33参与ALA诱导苹果花青苷积累的模型。首先，ALA处理上调MdNAC33表达。然后，MdNAC33通过三种方式来促进花青苷合成与积累。一，直接激活MdDFR和MdANS表达；二，直接激活调节基因如MdbHLH3，进而上调结构基因如MdDFR和MdUFGT表达；三，与转录因子MdMYB1互作，增强MdMYB1与靶基因结合，促进MdUFGT和MdGSTF12表达，最终，使得ALA处理后的苹果花青苷积累显著增加。本研究结果为ALA调控苹果花青苷积累提供了新的理论证据。

作者简介：

      论文DI一作者为南京农业大学果树学博士生张留孜，通讯作者为汪良驹教授、仲岩副教授。科研助理张建婷、硕士毕业生魏波、硕士研究生李亚格和方项博士在试验研究以及论文撰写过程中也发挥了重要作用。

     汪良驹教授是江苏省植物生理学会植物生长物质与生长调控ZHUAN业委员会主任。他于2000年起开始从事ALA在农林作物抗逆增产提质效应及其生物学基础研究。其研发的产品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已经大面积应用于QUAN国20多个省市区农业生产区。其团队先后获得20多项政府专项资金资助，在国内外学术期刊发表与ALA有关研究论文100余篇，GUO家授权专利20余项，处于5-A农业领域研究前沿。

资助基金：

江苏省农业自主创新资金重大项目——CX(20)2023

国JIA自然科学基金——32172512，31772253

江苏省碳达峰碳中和前沿基础项目——BK20220005

江苏省高校优势学科项目

阅读文章：https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2023.111949